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Nature | 張二荃實驗室證明調控晝夜節律的核心組分RUVBL2是真核生物鐘的共同起源分子
導讀 ?
Introduction
晝夜節律廣泛存在于地球上的生物體中，是生物體預知并響應環境的晝夜變化的重要機制。晝夜節律在維持生理穩態和人體健康中發揮著關鍵作用，其紊亂可能引發睡眠障礙、肥胖、免疫力下降等疾病，并增加癌癥及精神疾病的風險，對人類健康構成嚴重威脅。
生物鐘是晝夜節律的分子機制，以轉錄-翻譯負反饋環路(transcription–translation feedback loop, TTFL)的形式發揮功能。TTFL模型是20世紀90年代提出的，目前在不同生物鐘系統中得到了廣泛應用。然而，隨著研究的深入，TTFL理論面臨諸多挑戰。例如，盡管真核生物的生物鐘架構高度相似，但核心組分卻存在顯著差異。例如，植物缺乏與動物PERIOD蛋白相似的生物鐘成分，這表明當前發現的TTFL機制可能無法解釋真核生物鐘系統的共同起源。此外，僅依賴高能耗的轉錄和翻譯過程，或許難以支撐長達24小時的節律振蕩。而從結構生物學角度來看，迄今仍無法在真核生物體外重建類似藍藻PTO系統的24小時TTFL振蕩。這些證據均指向一個核心問題：單靠TTFL機制，難以解釋真核生物鐘的起源及其24小時震蕩的維持，因此晝夜節律的調控機制仍需進一步探索。
2025年3月26日，北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院張二荃實驗室在《Nature》發表題為“The P-loop NTPase RUVBL2 is a conserved clock component across eukaryotes”的研究論文。該研究在其團隊2020年發表于《Science Translational Medicine》的論文“Chemical perturbations reveal that RUVBL2 regulates the circadian phase in mammals”基礎上，進一步揭示了RUVBL2作為真核生物鐘的共同核心成分，并支持了最初在藍藻中發現的“緩慢ATP酶活性是生物鐘共同特征”的觀點。
在2020年的研究中，張二荃實驗室發現RUVBL2——一種低水解活性的AAA+ ATPase，在哺乳動物的生物鐘復合物(mega-dalton super-complex)中發揮關鍵作用，并調控晝夜節律的相位與振幅。然而，由于周期通常被認為是衡量晝夜節律功能更可靠的參數，而此前的研究缺乏直接證據表明 RUVBL2 參與周期調控，因此 RUVBL2 是否為核心生物鐘組分仍存在爭議。為了彌補這一缺陷，該研究團隊利用CRISPR/Cas9介導的高通量篩選技術，對近1000個RUVBL2敲入突變體進行全面分析。實驗結果表明，在人類U2OS細胞中，多個RUVBL2突變體呈現短周期、長周期或無節律的不同表型。這種通過靶向單一基因即可同時調控振幅、相位，并引起雙向周期變化的現象，僅在少數核心生物鐘基因(例如果蠅的Per和藍細菌的kaiC)中被觀察到。此外，RUVBL2的表達具有節律性、可被環境因子調節，并且其敲除會導致無節律表型，進一步證明了RUVBL2是生物鐘的核心成分(圖1)。
圖1：RUVBL2是生物鐘的核心組成成分(改編自原文)
(a) 在細胞中敲入突變會導致長周期、短周期或無節律的表型，而在小鼠SCN過表達RUVBL2突變體可重現長周期和短周期的節律變化。此外，細胞與小鼠的周期表型呈線性相關。
(b) 在小鼠SCN中敲除Ruvbl2會導致其在恒定黑暗條件下喪失活動節律。
為了探究RUVBL2如何影響生物鐘周期，研究團隊對突變位點進行了深入分析，發現這些突變主要集中在P-loop結構域——這一區域與ATP結合密切相關，提示RUVBL2可能通過ATP水解調控周期振蕩。進一步實驗顯示，RUVBL2突變體的周期調節獨立于TTFL復合物中的CRY，即便在CRY蛋白水平下降的情況下，周期表型仍然存在。這一發現表明RUVBL2可能通過不同于傳統TTFL途徑的方式影響生物鐘周期。
更重要的是，研究人員測定了RUVBL2及其突變體的ATP水解酶活性，結果顯示RUVBL2水解ATP的速度極慢，每24小時僅水解13個ATP分子。這一活性水平遠低于典型AAA+ ATP 酶，但與藍藻KaiC的ATP水解速率(每天15個ATP分子)相當。這種低活性可能是維持24小時周期震蕩的基礎。進一步分析發現，RUVBL2的ATP酶活性與細胞周期長度呈顯著負相關——較高的ATP酶活性對應更短的周期，較低的活性對應更長的周期，正如藍藻的KaiC一樣。結合結構分析和定點突變，研究者們發現，與KaiC類似，RUVBL1/RUVBL2晶體結構口袋里的水分子處于不利于對ATP進行親核攻擊的位置，導致RUVBL1/RUVBL2的ATP酶活性極低。這一發現進一步凸顯了RUVBL2與藍藻KaiC在生物鐘調節機制上的相似性，為揭示真核生物與原核生物生物鐘系統的進化關聯提供了有力證據(圖2)。
圖2：在人源RUVBL1/RUVBL2復合物的ATP結合口袋中，水分子的位置與藍藻KaiC相似，都處在一種非優化的進攻ATP γ-磷酸基團的狀態，因而決定了它們是一類極慢速的ATP水解酶。
RUVBL在真核生物中高度保守，其氨基酸序列相似性高達85%。通過梳理已有文獻，研究者們發現RUVBL蛋白廣泛分布于多種生物鐘超復合物中，表明其可能與不同物種的核心生物鐘成分存在潛在的相互作用。進一步結合免疫共沉淀和質譜分析，研究者們證實了RUVBL2的同源蛋白能夠與哺乳動物、果蠅、擬南芥乃至粗糙脈胞菌的核心生物鐘蛋白相互作用。此外，利用遺傳學操作和藥理學實驗，研究人員發現RUVBL2在果蠅、擬南芥和粗糙脈胞菌中的同源蛋白也參與晝夜節律調控，并且其ATP酶活性與周期長度的關系與哺乳動物和藍藻一致。這些證據進一步證實，RUVBL2作為保守的低活性ATP酶，在調節真核生物鐘周期方面發揮了關鍵作用。
基于這些發現，研究團隊提出了一個新的假設：在遠古生命起源階段，隨著原始生物鐘的出現，低活性的P-loop ATP酶成為生物鐘系統的核心組件。藍藻中，KaiC結合KaiA和KaiB組成了一個連接到TTFL的強大振蕩器，而在真核生物中，含有P環的AAA+ ATP酶RUVBL2及其同源蛋白通過與TTFL生物鐘蛋白相互作用，參與生物鐘的調控。KaiC和RUVBL2極低的ATP酶活性共同決定了生物鐘的24小時節律振蕩，這一機制或許是生物鐘系統進化的共同特征。
圖3：藝術化呈現的生物鐘起源模型(由徐占聰設計完成)
這個ATP酶驅動的沙漏隱喻了極慢的水解酶動力學決定了振蕩的速度，促成了24小時的晝夜節律。背景中組成六聚體的RUVBL2是真菌、果蠅、植物和小鼠生物鐘系統中的共同起源分子。
綜上所述，本研究在之前的工作基礎上，進一步證實了RUVBL2作為核心生物鐘組分的作用，還揭示了其ATP酶活性如何以類似KaiC的機制調節真核生物的晝夜節律。這一發現豐富了真核生物鐘的分子調節機制，并提出了低活性的ATP酶作為生物鐘起源核心組分的進化假設，在進化生物學和生物鐘研究領域具有重要意義。
北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院張二荃研究員為本文的通訊作者。張二荃實驗室的博士生廖媚妹、劉艷琴、和徐占聰為本文的共同第一作者。圣地亞哥大學晝夜節律中心的Susan S. Golden教授和方明旭博士在藍藻相關實驗方面提供了重要支持，美國德克薩斯大學生物鐘研究中心的Paul E. Hardin教授在果蠅實驗中亦給予了關鍵幫助。重慶醫科大學附屬第二醫院的鞠大鵬副研究員在該工作中提供了實驗和技術指導。該工作還得到了北京生命科學研究所王濤實驗室、蛋白質組中心和代謝組學中心的大力支持。研究過程中，還得到了國內諸多生物鐘課題組的幫助：秦曦明、徐小冬、何群實驗室分別提供了藍藻、擬南芥、真菌的部分實驗幫助；徐瓔教授提供了有益的討論建議；張勇、張珞穎、劉曉和馬定邦提供了實驗材料或數據庫支持。Joseph S. Takahashi、Michael Rosbash、Steve A. Kay、John B. Hogenesch、Achim Kramer、Michael Brunner 教授以及Neuroscience Pioneer Club的成員提供了寶貴的建議。本研究獲得了中國國家重點研發計劃（2024YFA1803200）、STI2030重大專項（2021ZD0203400）、北京市政府、清華大學，及美國NIH/NIGMS的資助。
論文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41586-025-08797-3
DOI：10.1038/s41586-025-08797-3
