The innovation | 曹鵬實驗室揭示咳嗽的神經中樞環路機制

導讀 ?

Introduction

2024年11月4日,北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院曹鵬實驗室在《The innovation》上在線發表了題為“Brainstem opioid peptidergic neurons regulate cough reflexes in mice”的研究論文。該研究開發了一種嶄新的三通道咳嗽行為范式,能同時監測小鼠胸膜內壓(Intrapleural pressure,IPP),腔內氣流(Boxflow)以及超聲(Ultra sound),并區分出咳嗽和打噴嚏兩種截然不同的呼吸道防御性反射,同時使用該行為范式,發現了小鼠孤束核(NTS)中的一群向呼吸中樞cVRG的谷氨酸能神經元投射的特異性的強啡肽能(Pdyn)神經元對咳嗽反射至關重要。

研究人員首先開發了一套可定量分析小鼠咳嗽的行為范式:通過使用全身體積掃描儀(whole-body plethysmography,WBP)、體內植入遙測裝置、超聲麥克風,可實時監測小鼠所在腔體的氣流波動(Boxflow),胸膜內壓(IPP)及細微聲音變化(Sonogram)。在該系統中使用辣椒素誘導成功誘導出Class I 和Class II兩種在聲音頻率、時長截然不同的氣道防御性反射。由于NG和TG的神經末梢分別大量支配著喉部和鼻腔黏膜,研究人員隨后使用化學遺傳抑制病毒(hM4Di)分別/同時抑制支配呼吸道的NG和TG中的Trpv1⁺神經元,分別/同時抑制了Class I 和Class II反射, 并分辨Class I為咳嗽反射。

利用辣椒素刺激FosTRAP2小鼠, 研究人員定位到dorsal vagal complex(DVC)腦區響應辣椒素引發的生理性咳嗽,通過對NTS的FISH染色,發現3種啡肽類物質(強啡肽prodynorphin ,腦啡肽proenkephalin,內啡肽proopiomelanocortin)特異性表達在DVC,通過化學遺傳抑制DVC中的Pdyn,Penk及Pomc神經元,其中,Pdyn⁺神經元抑制能顯著減少辣椒素或檸檬酸引發的咳嗽。

同時,研究人員對Pdyn-Cre小鼠的NTS腦區注射AAV-DIO-GCaMP并包埋光纖,利用光纖記錄手段,研究人員發現小鼠的呼吸與GCaMP信號存在偶聯且咳嗽能大幅度引起Pdyn⁺ NTS神經元GCaMP信號上升,但是打噴嚏則對Pdyn⁺ NTS神經元GCaMP信號無明顯影響,為了進一步確定Pdyn⁺ NTS神經元與咳嗽相關的GCaMP信號是否由外周的Trpv1⁺迷走神經傳入,研究人員使用單側迷走神經截斷術或Trpv1-KO小鼠進行Pdyn⁺ NTS神經元的光纖記錄實驗,發現單側迷走神經截斷術或Trpv1的敲除,均能減弱咳嗽引發的Pdyn⁺ NTS神經元GCaMP信號的上升。從而確認了Pdyn⁺ NTS神經元接收來自Trpv1⁺ 迷走神經的信號輸入并響應咳嗽。

為了進一步驗證Pdyn⁺ NTS神經元的激活是否是引發咳嗽的充分條件,研究人員對Pdyn-Cre小鼠NTS腦區雙側注射了AAV-DIO-hM3Dq,使用化學遺傳學手段激活Pdyn⁺ NTS神經元,結果表明,這群神經元的激活能有效引起咳嗽且不改變小鼠的呼吸速率,由此激發的咳嗽各類指標與辣椒素誘發的咳嗽一致。此外,研究人員對Pdyn-Cre 小鼠的NTS腦區注射AAV-DIO-ChR2并包埋光纖,光激活Pdyn⁺ NTS神經元同樣能有效地誘發咳嗽。這些結果表明, Pdyn⁺ NTS神經元的激活對誘發咳嗽反射是充分條件。

為了探究Pdyn⁺ NTS神經元的下游通路,研究人員對Pdyn-Cre小鼠NTS腦區注射AAV-DIO-EGFP-Syb2,發現EGFP⁺ 的末梢主要出現在cVRG及同側中間網狀核(IRt) 。為確定Pdyn⁺ NTS-cVRG 和Pdyn⁺ NTS-IRt 在咳嗽反射中的作用,研究人員在Pdyn-Cre小鼠NTS腦區注射AAV-DIO-hM4Di并在cVRG或IRt包埋給藥管,通過精準腦區遞送CNO抑制來自Pdyn⁺ NTS的信號,結果發現Pdyn⁺ NTS-cVRG的抑制能有效減少辣椒素誘發的咳嗽,表明Pdyn⁺ NTS-cVRG環路功能對咳嗽反射是必要的。為進一步確定Pdyn⁺ NTS-cVRG環路在咳嗽反射的功能,研究人員對Pdyn-Cre小鼠的NTS注射AAV-DIO-ChR2并在cVRG包埋光纖,結果表明光激活NTS-cVRG的末梢能穩定地引發咳嗽反射,此外,作者對WT小鼠的cVRG注射AAV-ChR2-EYFP并包埋光纖,直接對cVRG的激活也能穩定地引發咳嗽反射。接下來，作者研究了Pdyn⁺ NTS cVRG通路是否與咳嗽相關肌肉通過突觸連接。為了驗證這一點，研究人員將AAV-DIO-EGFP-Syb2注射到Pdyn IRES Cre小鼠的DVC中，并將表達dsRed的偽狂犬病毒(PRV)注射到橫膈膜、肋間肌和腹部肌三個肌肉群中,實現dsRed+神經元在幾個大腦區域逆行標記。在cVRG中，dsRed+神經元與源自Pdyn⁺ NTS神經元的EGFP-syb2+軸突末梢相互分散。這些形態學結果表明，Pdyn⁺ NTS cVRG通路可能通過跨突觸調節咳嗽相關肌肉,進而調控咳嗽反射。

綜上所述,本研究開發了一種三通道監測的小鼠咳嗽行為范式,并以此范式,揭示了一條調控咳嗽反射的特異性環路: Pdyn⁺ NTS-cVRG;為后續咳嗽的深層神經機制研究奠定重要基礎。

北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院曹鵬高級研究員為本文通訊作者。曹鵬實驗室2022級TIMBR博士生盧海成,2022級PTN博士生鄭文萱,博士后陳國慶,趙淼,谷華婷,黃美珠,首都醫科大學碩士研究生李夏婷為本文共同第一作者。該研究得到北京市科委、清華大學生物醫學交叉研究院以及北京生命科學研究所的資助。